Odpowiedź organizmu na atak wirusa
Po wniknięciu wirusa do organizmu pierwszym wykrywalnym znacznikiem (markerem) jest RNA wirusa HCV pojawiający się w osoczu 1-2 tygodnie po zakażeniu. Stężenie RNA stopniowo rośnie, jednak wraz z rozwojem odpowiedzi immunologicznej zaczyna opadać; w około 15% przypadków przejściowo wynik badania RNA może być ujemny.
Drugim wykrywalnym znacznikiem są przeciwciała anty-HCV pojawiające się średnio 8-10 tygodni po zakażeniu. Po okresie ostrej infekcji, który u większości osób jest niemy klinicznie, w 75-85% przypadków dochodzi do rozwoju przewlekłego zakażenia HCV.
W okresie przejściowym między ostrą i przewlekłą fazą zakażenia, okresowo stwierdzana może być obecność RNA HCV oraz podwyższone wartości aminotransferazy alaninowej (AlAT); najczęściej parametry te mogą być dodatnie wiele lat po zakażeniu, chociaż w 15-25% przypadków przewlekłego zakażenia wartości AlAT mogą utrzymywać się w granicach wartości prawidłowych [1].
Diagnostyka
Aktualnie nie są dostępne w handlu żadne testy pozwalające na wykrywanie antygenów HCV, chociaż opracowano bardzo czuły test wykrywający białko rdzeniowe tego wirusa. Większość testów wykrywających zakażenie HCV mierzy obecność przeciwciał wytwarzanych przez organizm przeciwko wirusowi [1].
Testy serologiczne
EIA-2 (druga generacja) – pozwalają wykrywać przeciwciała skierowane przeciwko antygenowi wirusa anty-HCV, które zwykle pojawiają się średnio 80 dni (zakres od 33 do 129 dni) po zakażeniu. Pacjenci z obniżoną odpornością oraz poddawani dializom mogą w rzadkich przypadkach wykazywać brak przeciwciał wykrywanych przez EIA-2, pomimo innych dowodów na aktywne zakażenie wirusem [1].
EIA-3 (trzecia generacja) – wykrywa przeciwciała anty-HCV. Metoda została zaakceptowana przez FDA. EIA-3, są testami o większej czułości i specyficzności niż uprzednio stosowane. Mimo to, nawet podczas stosowania tych testów zdarzają się przypadki odpowiedzi fałszywych (fałszywie-dodatnich lub fałszywie-ujemnych) [1].
ELISA (obecnie: III generacji), umożliwiająca wykrywanie przeciwciał anty-HCV. Czułość diagnostyczną testów III generacji określa się na 99,4% do 99,9%. U ok. 7% immunokompetentnych zakażonych w ogóle nie stwierdza się anty-HCV [2].
Metoda immunoblottingu „Western blot”.
Metodę tę stosuje się jako tzw. test potwierdzenia. Surowica jest inkubowana na nitrocelulozowych błonach, na których umieszczone są cztery rozdzielone białka wirusowe (HCV). Jeżeli w surowicy znajdują się przeciwciała anty HCV, to reagują one z antygenowymi białkami wirusa znajdującymi się na błonie. Zmiana koloru (reakcja barwna dzięki dodanemu enzymowi) wskazuje na to, że przeciwciała reagują z białkami. Test jest uznawany za dodatni, gdy reakcja dotyczy co najmniej dwóch białek wirusa, natomiast gdy dotyczy tylko jednego białka wirusa, traktowany jest jako nieokreślony lub wątpliwy.
Testy immunoblot są pomocne w niektórych sytuacjach klinicznych. Stosuje się je w celu weryfikacji rozpoznania u chorych, u których np. wykryto przeciwciała anty HCV metodą EIA, ale u których nie stwierdza się obecności HCV RNA. Taka sytuacja może wystąpić u osób po przebytym zakażeniu HCV lub w przypadku przewlekłego zakażenia, gdy ilość cząsteczek wirusa jest na tyle mała, że staje się ona niewykrywalna (takie przypadki zdarzają się coraz rzadziej z uwagi na coraz większą czułość badania PCR). Jeżeli test immunoblot -anty HCV jest pozytywny, świadczyć to może o tym, iż pacjent jest ozdrowieńcem po przebytym zapaleniu wątroby typu C i ma przetrwałe przeciwciała przeciwko wirusowi. Jeżeli test immunoblot jest negatywny, test EIA najprawdopodobniej był fałszywie dodatni [3].
Rekombinowane testy immunoblot (RIBA).
Testy uzupełniające do oznaczania przeciwciał anty-HCV (RIBA) powinny być wykorzystywane w celu potwierdzenia wcześniejszego zakażenia HCV u pacjentów, u których wynik badania RNA wirusa jest ujemny. Rekombinowane testy immunoblot (RIBA) zawierają te same antygeny HCV co testy EIA, a także dysmutazę nadtlenkową (SOD) do wykrywania nieswoistych przeciwciał przeciwko białkom drożdży (antygeny HCV są zwykle uzyskiwane z zastosowaniem drożdży). Dodatni wynik testu RIBA definiowany jest jako reaktywność na dwa lub więcej antygeny HCV, przy braku reaktywności na SOD. Reaktywność na pojedynczy antygen wirusa HCV lub reaktywność w szerokim zakresie antygenów wraz z reakcją na SOD uznawane są za wyniki nieokreślone. U osób świeżo zakażonych testy RIBA dają wynik dodatni tylko w 85% przypadków. Tak więc w populacjach o wysokim ryzyku zakażenia niema konieczności wykonywania tych testów w celu zdiagnozowania zapalenia wątroby typu C [1].
Wykrywanie RNA wirusa
Najważniejszym testem wykrywającym zakażenie HCV jest stwierdzenie obecności materiału genetycznego wirusa C – RNA. RNA HCV może być wykryty w ciągu 1-2 tygodni po ostrym zakażeniu, czyli kilka tygodni przez pojawieniem się nieprawidłowych wartości enzymu aminotransferazy alaninowej (AlAT) oraz przed pojawieniem się przeciwciał anty-HCV [1].
Do wykrywania HCV-RNA służy kilka metod, a wśród nich:
- Hybrydyzacja z amplifikacją sygnału (Quantiplex HCV, Chiron bDNA signal amplification assay).
- Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) z odwrotną transkrypcją RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction),
- Reakcja łańcuchowa ligazy (Abbott).
- NASBA (nucleic acid sequence-based amplification).
Metoda PCR
Amplifikacja, czyli namnożenie materiału genetycznego wirusa umożliwia wykrycie małej ilości cząsteczek wirusa w surowicy. Testy umożliwiające wykrycie HCV RNA są specyficzne i stanowią skuteczną metodę potwierdzającą obecność czynnego zakażenia. Testy te najczęściej wykonuje się u osób, u których aktywność aminotransferaz jest prawidłowa lub jedynie nieznacznie zwiększona, kiedy nie stwierdza się obecności przeciwciał antyHCV i w niektórych innych przypadkach diagnostyki chorób wątroby. Lekarz, zlecając oznaczenie HCV RNA metodą PCR powinien skierować chorego do sprawdzonej, wiarygodnej pracowni. Pomimo braku akceptacji ze strony FDA, testy wykorzystujące metodę PCR z odwrotną transkrypcją (RT) do wykrywania RNA wirusa HCV są powszechnie stosowane w praktyce klinicznej; najczulszy z nich wykrywa >50 kopii RNA/ml [1].
Ilościowe oznaczanie HCV RNA w surowicy
Oznaczenia ilościowe RNA wirusa HCV powinny być wykorzystywane do monitorowania odpowiedzi na leczenie przeciwwirusowe.
Istnieje kilka metod umożliwiających pomiar ilości lub stężenia wirusa w surowicy: Są to metody z zastosowaniem technik hybrydyzacji (PCR i bDNA – branched DNA signal amplification assay). Nie ma standaryzacji metod ilościowych i to powoduje, że wyniki badania tej samej próbki w różnych laboratoriach różnią się między sobą. Dodatkowym utrudnieniem jest fakt, że stężenie HCV RNA w surowicy może się zmieniać samoistnie 3-10 razy.
Pomimo tych niedogodności dobrze wykonane badanie ilościowe dostarcza ważnych informacji o przebiegu zakażenia HCV. Częstość pozytywnych odpowiedzi na leczenie jest większa u chorych z małym stężeniem HCV RNA. Istnieje kilka definicji małego stężenia HCV RNA, lecz najczęściej określa się tym mianem liczbę cząsteczek wirusa mniejszą niż 2 miliony kopii na mililitr (ml). Monitorowanie liczby cząsteczek wirusa na wczesnym etapie leczenia może informować o prawdopodobnej odpowiedzi na leczenie. Jednak z uwagi na wymienione niedogodności testów nie powinny być one stosowane rutynowo. Konieczne jest opracowanie testów czulszych i bardziej wiarygodnych [3].
Biopsja wątroby
Biopsja wątroby nie jest warunkiem rozpoznania choroby, jest jednak pomocna w określeniu stopnia ciężkości choroby, zaawansowania procesu włóknienia, oraz trwałości uszkodzenia struktury zrazikowej wątroby. Barwienia podstawowe: hematoksylina i eozyna oraz metody trójbarwne np. wg Massona są stosowane w celu określenia stopnia martwicy, aktywności zapalnej oraz stopnia włóknienia. Specyficzne barwienie na obecność HCV nie jest badaniem rutynowym. Biopsja wątroby jest także pomocna w diagnozowaniu innych chorób wątroby, jak uszkodzenie alkoholowe czy hemochromatoza [3].
Wynik biopsji wątroby: poza ogólnym opisem pobranego bioptatu, wynik zawiera zazwyczaj oznaczenie stanu zapalnego wątroby i stanu jej zwłóknienia, obydwie normy są w skali od 0 do 4. Gdzie „zero” oznacza wynik bardzo dobry (upraszczając), a „cztery” bardzo zły w odniesieniu i do stanu zapalnego, a także do stanu zwłóknienia. Wykonanie biopsji, powinno być (zalecane) wykonywane przy monitorowaniu wprowadzanej igły, za pomocą aparatury ultrasonograficznej (USG). Wyniki tych wszystkich wykonanych badań z kolei, kwalifikują, lub nie, do leczenia terapią skojarzoną interferonem alfa i rybawiryną [4].
Zastosowanie biologii molekularnej w badaniu bioptatu (tkanka wątroby)
Diagnostyka z zastosowaniem przeciwciał w celu wykrycia antygenu HCV w bioptacie wątroby jest przedmiotem prac badawczych. Jednak testy te nie są komercyjnie dostępne i nawet podczas badań przeprowadzanych przez naukowców wykrywalność antygenu HCV w tkance wątroby wynosi zaledwie około 60-70% w grupie chorych na przewlekłe zapalenie wątroby typu C, w większości dotyczy to chorych z dużą wiremią w surowicy. Testy te wymagają specjalnego przechowywania tkanki wątroby i dlatego nie są zalecane do badań rutynowych [3].
Analiza wyników badań
Ostre wirusowe zapalenie wątroby typu C
Rozpoznanie ostrego zapalenie wątroby typu C opiera się na stwierdzeniu objawów, takich jak: żółtaczka, łatwe męczenie się i nudności z towarzyszącym zwiększeniem aktywności enzymów wątrobowych, głównie AIAT (zwykle 10-krotnie; wartości referencyjne dla AIAT 5-40 U/I ) oraz obecnością przeciwciał anty HCV. Niekiedy diagnostyka ostrego zapalenia może być trudna, ponieważ przeciwciała anty HCV nie zawsze są obecne w początkowym okresie choroby. U około 30-40% chorych przeciwciała anty HCV nie są wykrywane w okresie 2-8 tygodni po wystąpieniu objawów chorobowych. W takich przypadkach rozpoznanie można potwierdzić, wykonując oznaczenia HCV RNA w surowicy, lub powtarzając oznaczenia przeciwciał anty HCV po upływie miesiąca od pierwszych objawów chorobowych.
Przewlekłe wirusowe zapalenie wątroby typu C
Przewlekłe wirusowe zapalenie wątroby typu C rozpoznaje się wtedy, gdy w surowicy występują przeciwciała anty HCV, a zwiększona aktywność aminotransferaz w surowicy utrzymuje się co najmniej 6 miesięcy. Oznaczenie HCV RNA metodą PCR potwierdza rozpoznanie i jednocześnie dokumentuje obecność wiremii – namnożenia się wirusa. U prawie wszystkich chorych na przewlekłe zapalenie wątroby typu C stwierdza się obecność genomu wirusa wykrywalnego metodą PCR.
Problem diagnostyczny stanowią ci chorzy, u których nie są wytwarzane przeciwciała anty HCV z powodu nieprawidłowej czynności układu odpornościowego. W takich przypadkach zaleca się oznaczenie HCV RNA. Rozpoznanie jest także trudne w przypadku chorych, u których stwierdza się przeciwciała anty HCV i jednocześnie występowanie innej choroby wątroby, np. zapalenia alkoholowego, autoimmunologicznej choroby wątroby lub zaburzeń związanych z nadmiernym gromadzeniem żelaza – hemosyderozy lub hemochromatozy. W takich przypadkach może to oznaczać wynik fałszywie dodatni albo świadczący o przebytym zakażeniu lub o obecnym łagodnym zakażeniu, które zaostrzyło się w wyniku innej choroby podstawowej. Także u tych chorych zaleca się oznaczenie HCV RNA [3].
Fibroscan®.
Metoda nieinwazyjna pomiaru zwłóknienia (i stłuszczenia) wątroby. To nowy standard diagnostyczny chorób wątroby, zastępujący coraz częściej biopsję wątroby. Skuteczność diagnozy jest porównywalna z biopsją (wyniki porównawcze obu metod w wielu badaniach klinicznych), możliwość częstego powtarzania bez szkody dla pacjenta [4].
Jak działa FibroScan®?
Głowica urządzenia, w kontakcie ze skórą pacjenta, generuje impuls mechaniczny. Fala przechodzi przez tkanki podskórne i dochodzi do wątroby. W tym czasie głowica wysyła ultradźwięki, które służą pomiarowi prędkości rozchodzenia się fali. Szybkość jej przemieszczania jest zależna od stopnia twardości wątroby. Prędkość jest tym większa im większe jest zwłóknienie i sztywność wątroby. Wyniki pomiarów prędkości fali są komputerowo przetworzone, a wynik końcowy. Zobrazowanie zasady działania można naleźć TUTAJ [4].
Żródła :
[1] : www.nacb.org
[2] : www.borgis.pl
[3] : www.mp.pl
[4] : www.prometeusze.pl
Opracowanie zaczerpnięte z (nieistniejącej już) strony : www.diagnostykalab.pl
